前列腺癌是男性最常见的原发性肿瘤，具有高度向骨转移的倾向。前列腺癌骨转移伴随活跃的病理学骨重塑，导致死亡率和发病率升高。对骨转移进行详细表征对于前列腺癌的管理至关重要。本研究应用拉曼光谱技术调查前列腺癌转移性骨的结构和组成，最终目标是识别与骨转移发展过程中骨质量改变相关的光谱特征。本研究使用台式拉曼显微光谱技术对来自前列腺癌患者的成骨性、溶骨性及无肿瘤骨标本进行检测。计算了拉曼衍生的胶原矿化、矿物结晶度和碳酸盐取代等测量指标。结果显示，溶骨性病变表现出显著较低的胶原矿化（通过磷酸ν1/脯氨酸比值测定）以及比正常骨和成骨性骨更高的碳酸盐取代。成骨性和溶骨性标本的矿物结晶度均显著降低。此外，在成骨性标本中观察到羟脯氨酸:脯氨酸比值的显著增加，表明成骨性病变中羟脯氨酸含量增加。本研究表明，拉曼光谱技术在确定成骨性和溶骨性骨转移的改变以及评估转移性骨对治疗的反应方面具有应用前景。

一、引言

前列腺癌是北美男性最常见的原发性肿瘤，2005年影响近190,000人。它也是美国男性癌症死亡的主要原因。前列腺癌具有高度向骨转移的倾向，导致癌症患者死亡率和发病率升高，如部分瘫痪、高钙血症、病理性骨折和骨痛。约70%死于前列腺癌的患者伴有骨转移。由于骨转移具有重要的临床意义，研究工作一直致力于了解肿瘤细胞如何影响转移部位的骨组织。

正常骨骼处于不断重塑状态。骨重塑是一个动态过程，分别通过破骨细胞和成骨细胞的活动将骨吸收与骨形成偶联。在前列腺癌中，骨吸收与骨形成过程的偶联被破坏，导致活跃的病理学骨重塑。前列腺癌骨转移通常表现为成骨性，其特征是由于成骨细胞活动过度增强而导致骨形成增加。然而，部分前列腺癌患者也表现为溶骨性（即骨破坏性）或溶骨/成骨混合性病变。对骨组织结构和组成改变的详细表征对于前列腺癌的管理至关重要。

拉曼光谱是一种无创振动光谱技术，可提供组织中的分子特异性信息。该技术已广泛应用于骨研究领域，用于表征骨基质和矿物质性质。该技术已证明其能够确定疾病引起的骨质量改变以及评估随年龄增长的骨脆性。研究人员曾报道拉曼光谱参数与骨组织力学特性之间存在显著相关性。骨折风险的决定因素，如骨组织矿化、胶原质量和骨磷灰石晶体结构，均已使用这种光学技术进行表征。据研究人员所知，此前尚无研究使用拉曼光谱对转移性癌症的骨骼进行专门比较。

在本研究中，研究人员假设拉曼光谱能够检测前列腺癌转移引起的骨改变。主要目标是使用拉曼光谱表征骨转移的结构和组成特性。了解骨成分的改变可为骨肿瘤发病机制提供见解，并为治疗干预的发展提供指导。

二、材料与方法

2.1 骨样本

本研究使用的骨标本来自死于晚期前列腺癌并接受快速尸检的患者，该尸检在华盛顿大学前列腺癌捐献者计划的监督下进行。该计划此前已有描述，并已获得当地机构审查委员会批准。使用带有环形钻头（直径11毫米钻头）的无线电钻从预定的骨部位获取骨芯。如果骨质高度成骨性，则用冷无菌PBS冷却环形钻头。部分标本由病理学家评估并分级为正常骨、成骨性骨和溶骨性骨。标本用70%乙醇固定，随后进行μCT和拉曼测量。

2.2 μCT

将骨芯浸泡在酒精中，使其长轴与显微计算机断层扫描系统（μCT40；Scanco Medical；瑞士）的扫描轴对齐，使用相同的标准管尺寸（直径12.3毫米）。在16微米体素大小（各向同性）下，扫描骨芯获取500个投影，扫描角度180º。X射线源设置为55 kV和145 mA，积分时间为300毫秒。重建后，使用410‰（或763.2 mgHA/cm^(3)）的阈值、0.8的高斯噪声滤波器和2的支持度，将骨组织与空气或软组织分割。利用Scanco评估软件（中轴脚本），定量分析骨小梁体积分数和骨小梁数量。记录每个骨芯矿化骨的平均体积骨矿物质密度（mBMD）。

2.3 拉曼光谱

在进行拉曼显微光谱分析之前，将骨标本解冻并在室温空气中部分脱水半小时，然后进行拉曼光谱采集。随后使用共聚焦拉曼显微镜（Renishaw，Ramascope Mark III）配备785纳米激光二极管光源（Innovative Photonic Solutions），沿骨芯长轴从标本表面采集拉曼光谱。50倍物镜将光聚焦到样品表面5微米的光斑上。拉曼散射光然后通过35微米狭缝，由光谱分辨率为3 cm^(-1)的光谱仪收集。每个采集光谱由三次累积组成，曝光时间为10秒，分档为3。对于每个骨芯，沿骨芯长轴随机采集十个光谱以确保测量的可重复性。通过改进的多项式拟合算法减去光谱中的背景荧光。

骨特征峰的拉曼位移和归属列于表1。使用定制开发的Matlab程序（Matlab，Mathworks）计算酰胺I（1665 cm^(-1)）、CH2摇摆（1450 cm^(-1)）、酰胺III（1250 cm^(-1)）、B型碳酸盐（1070 cm^(-1)）、脯氨酸（856 cm^(-1)）以及磷酸ν1（960 cm^(-1)）和ν4（588 cm^(-1)）的峰强度。

2.4 统计分析

所有拉曼和μCT参数均使用Excel中的双尾分布t检验进行组间比较。统计显著性定义为p值小于0.05。

三、结果与讨论

3.1 μCT测量

进行定量μCT以测量骨标本的结构特性和骨矿物质密度（BMD）。图1显示了正常骨、溶骨性骨转移和成骨性骨转移的代表性μCT图像。对照组显示骨小梁与溶骨性骨相当。成骨性骨转移与溶骨性骨转移之间的骨体积差异明显。成骨性骨显示骨体积/总组织体积（BV/TV，图2A）和骨小梁数量（图2B）显著增加，表明骨再生过度。BMD组间无显著差异（图2C）。然而，成骨性和溶骨性骨的标准差相对较大。这些变化表明转移部位存在成熟和新形成的骨，这一点已通过骨组织形态计量学证实（数据未显示）。绿色圆圈在图像上标记了骨体积和BMD计算感兴趣区域（图1）。

图1. 对照组（A）、溶骨性（B）和成骨性（C）标本的代表性μCT图像。绿色圆圈标记了骨体积和BMD计算感兴趣区域。

图2. 组间骨小梁BV/TV（A）、骨小梁数量（B）和BMD（C）的比较。星号（*）表示具有统计学显著差异（p < 0.05）。

3.2 拉曼光谱

每组采集的代表性拉曼光谱如图3所示。骨的特征拉曼信号在图中标注。在876 cm^(-1)至900 cm^(-1)范围内检测到显著的峰位移，从876 cm^(-1)（基于先前骨拉曼研究中的羟脯氨酸环呼吸模式分配）移至856 cm^(-1)（脯氨酸）。因此，计算876 cm^(-1)与856 cm^(-1)的峰高比，以显示相对于局部基线从820-900 cm^(-1)的羟脯氨酸相对含量（由图3中的虚线说明）。与溶骨性骨相比，成骨性标本中羟脯氨酸含量显著增加（图4A），表明成骨性转移灶中骨形成更加活跃。

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碳酸盐峰与磷酸ν1的峰高比被用来显示磷灰石结构中碳酸盐取代的程度。矿物结晶度通过取磷酸ν1峰半高全宽（FWHM）的倒数（1/FWHM）来评估。拉曼衍生的矿物结晶度已被证明与化学计量完美度和晶体尺寸相关。胶原矿化基于磷酸ν1与脯氨酸的峰高比计算。与正常骨或成骨性骨相比，溶骨性标本表现出显著较低的胶原矿化（图4B），表明溶骨性病变导致骨强度减弱。成骨性骨的矿物结晶度降低（图4C），表明新形成的骨具有较小的晶体尺寸。溶骨性标本也显示出出乎意料的较低结晶度（图4C），可能是由于碳酸盐取代增加（图4D）导致晶体结构不完善所致。

图3. 从对照组（上）、溶骨性（中）和成骨性（下）骨采集的代表性拉曼光谱。本研究中使用的特征峰归属在图中标注。

图4. 基于羟脯氨酸/脯氨酸（A）、磷酸ν1/脯氨酸（B）、矿物结晶度和碳酸盐/磷酸ν1计算的峰高比。星号（*）表示具有统计学显著差异（p < 0.05）。

尽管无统计学显著性，但成骨性骨显示出羟脯氨酸（p = 0.13）和胶原矿化（p = 0.10）高于正常骨的趋势。成骨组相对较高的标准差导致了这一无显著性比较结果，可能是由于成骨性骨形成程度的变化所致。更大的样本量可能为成骨性骨与对照组的比较提供更可靠的统计学结论。

四、结论

本研究应用拉曼光谱技术体外研究骨转移的组成特性。已识别出成骨性和溶骨性病变的 spectral markers。因此，拉曼光谱在确定骨转移引起的骨质量改变方面具有巨大潜力。随着基于光纤探针的拉曼系统的发展，非侵入性体内拉曼测量变得切实可行。在癌症研究领域，由于拉曼探针对细胞外基质内结构及环境变化的高敏感性，已证明其能够区分正常和病变组织。此前已有拉曼光谱在骨研究中体内应用的报道。因此，拉曼光谱可提供对转移性骨质量的非破坏性体内表征，并最终成为评估药物反应的有效工具。

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